細(xì)胞介紹

克隆Neuro-2A是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立,。該細(xì)胞產(chǎn)生大量微管蛋白，此蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中起應(yīng)答軸漿流動的收縮系統(tǒng)作用,。

該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶Luc基因,。

細(xì)胞特性

1）來源：腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤

2）形態(tài)：阿米巴樣干細(xì)胞

3）含量：>1x106細(xì)胞數(shù)

4）規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)用途：僅供科研使用,。

細(xì)胞篩選

該細(xì)胞為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Luc的細(xì)胞,，隨細(xì)胞傳代次數(shù)的增加,，其Luc熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度,，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選,。

建議收到細(xì)胞后至少傳3代，凍存留種后再進行篩選,。

初次進行細(xì)胞篩選時,，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的**培養(yǎng)基維持培養(yǎng),，若無細(xì)胞漂浮或者漂浮較少,，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的**培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，以此類推,，至**藥物濃度為5ug/ml,。若篩選過程中，漂浮細(xì)胞大于60%,，則停止篩選,，換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，至細(xì)胞密度約80%,，可繼續(xù)加入同濃度嘌呤霉素進行篩選,。當(dāng)加入5ug/ml嘌呤霉素時細(xì)胞正常增殖，可停止篩選,，用不含藥**培養(yǎng)基正常培養(yǎng),。

運輸和保存

干冰運輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱**夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇,，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈,、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染,，請立即與我們聯(lián)系,。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作,。

細(xì)胞接收后的處理

1）收到細(xì)胞后,，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損,、有液溢出及細(xì)胞有污染,，請拍照后及時聯(lián)系我們,。

2）請在4或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時給剛收到的細(xì)胞拍照（10×,，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存,，作為售后時收到時細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。

3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h,，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長和貼壁情況,，有些貼壁細(xì)胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長密度若在60%以下,，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收,，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的**培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。若細(xì)胞生長密度達70%-80%以上,，可以對細(xì)胞進行傳代處理。傳代過程中,，若因運輸振動脫落的細(xì)胞需要離心回收,。

4）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的**培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞,。收到細(xì)胞后**次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代,。

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清,，10%,；雙抗，1%,。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；二氧化碳,，5%,。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%,。

3）凍存液：90%血清,，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配,。

二．細(xì)胞處理：

1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入到含4-6mL**培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min,，棄去上清液,，**培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml**培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜,。**天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度,。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法

1.棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣,、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL,，T75瓶2-3mL）,，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,，若細(xì)胞大部分變圓并脫落,，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化,。

3.輕輕打勻后吸出,，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的**培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力,，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進行,。

3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。

下面T25瓶為例,；

1.細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù),，來決定細(xì)胞的凍存密度,。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.

2.1000rpm離心3-5min，去掉上清,。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞,，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱,、代數(shù),、日期等信息。

3.將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中,，-80度冰箱中過夜,，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用,。